پدرش یهودی روسی الاصل بود وعلاوه بر طراحی مبلمان به عنوان خیاط در کمپانی کلمبیا کار می‌کرد و مادرش یک هنرپیشه آماتور تئاتر بود.
هافمن در ابتدا برای پزشکی درس خواند اما پس از مدتی تحصیل را رها کرد و به شغل‌های مختلفی مثل دستیاری روانپزشکی، پیشخدمتی، ظرف‌شوری، تایپیستی و روزنامه‌فروشی پرداخت تا اینکه به هنرستان موسیقی و هنر لس‌آنجلس آمریکا راه یافت.
او قبل از رفتن به نیویورک، وارد کالج شهر سانتا مونیکا شده بود. در همان ایام در چند نقش ساده روی صحنه رفت و بعد از عدم موفقیت، مدتی بازیگری را رها کرد و در سال ۱۹۶۰، اولین نقش روی صحنه‌اش را در محصولی از گراتراد استین با نام بلی گفتن برای مرد جوان ایفا کرد.
پس از آشپز برای آقای جنرال او به تلاش‌هایش ادامه داد و چندین سال روی صحنه ظاهر نشد که در این خلال به تحصیل و فعالیت در استودیوی بازیگران لی‌استراسبرگ می‌پرداخت تا به بازیگری دارای متد تبدیل شود.
وقتی در اواخر دهه ۶۰ وارد سینما شد کمتر کسی فکر می‌کرد که او با این جثه نحیف و دماغ دراز ممکن است بتواند به یکی از بازیگران صاحب سبک سینمای آمریکا تبدیل شود.
زمانی که او وارد سینما شد، کلینت ایستوود با وسترن‌های اسپاگتی غوغا می‌کرد، رابرت دنیرو و آل پاچینو هر یک با نقش‌های بزرگی که ایفا کردند، استعداد فوق‌العاده خود را به رخ کشیدند و هافمن تازه فهمید که شاید در حساس‌ترین موقعیت تاریخی وارد سینما شده.
داستین هافمن هرگز شمایل یک قهرمان هالیوودی را نداشته است. قد کوتاه او و تند تند حرف زدن و بالا و پایین پریدنش هیچ ربطی به وقار و آقامنشی بازیگران طلایی سینمای آمریکا ندارد.
هافمن در ابتدای دهه ۱۹۶۰ کارش را با بازی در نقش‌های فرعی سریال‌های تلویزیونی شروع کرد اما اولین نقش جدی او در سینما برایش یک موفقیت بزرگ محسوب می‌شد.
مایک نیکولز کارگردان خوش فکر و جوان آن روزهای هالیوود که با ساخت اولین فیلمش در سال ۱۹۶۶ با نام چه کسی از ویرجینیا وولف می‌ترسد به موفقیت‌های بسیاری رسیده بود، برای نقش اصلی فیلم دومش فارغ التحصیل (۱۹۶۷) داستین هافمن گمنام را انتخاب کرد.
بازی او دراین فیلم ودر نقش بنیامین آنقدر درخشان بود که او را کاندیدای دریافت اسکار کند و حتی بازی آن بنکرافت بزرگ را تحت الشعاع خود قرار دهد. البته هافمن در همین سال در فیلم دیگری با نام میلیونرهای مدیگان هم بازی کرد که با توجه به اینکه این فیلم پس از فارغ التحصیل اکران شد بازی او در آن بسیار مورد توجه قرار گرفت.
وی در سال ۱۹۶۴ در چند تئاتر مثل در انتظار گودو و پیشخدمت زبان بسته بازی کرد و ۲ سال بعد او جایزه اوبی را برای بازی‌اش در سفر پنجمین سواره بدست آورد.
در سال ۱۹۶۹ هافمن بازی زیبا و به یاد ماندنی در نقش راستو در درام انتقادی و متفاوت کابوی نیمه شب از خود نشان داد که تحسین همگان را برانگیخت.
او در این فیلم نقش یک بیمار مبتلا به سل را که یک پایش لنگ بود و با لکنت حرف می‌زد آنقدر خوب ایفا کرد که داوران آکادمی فراموش کردند نقش اول فیلم جان وین بوده و هافمن را کاندیدای کسب اسکار کردند! و بدون شک اگر بازی فوق‌العاده اسطوره سینمای وسترن جان وین در فیلم شهامت واقعی نبود اسکار به هافمن می‌رسید.
در سال ۱۹۷۰ داستین هافمن با بازی در فیلم بزرگ مرد کوچک به کارگردانی آرتور پن مقام خود را به عنوان یک بازیگر پولساز تثبیت کرد.
بزرگمرد کوچک پرفروشترین فیلم سال شد. منتقدان آن را تحسین کردند اما در آن سال‌ها که مصادف بود با شکست آمریکا در ویتنام و افزایش نارضایتی‌ها از سیاست‌های آمریکا در داخل کشور ساخت فیلمی چنین ضد آمریکایی به مذاق آکادمی خوش نیامد و عملا فیلم را تحریم کردند.
در سال ۱۹۷۱ هافمن این فرصت را یافت تا در برابر دوربین سام پکین پا ایفای نقش کند. وی که پس از ساخت این گروه خشن بسیار مشهور شده بود هافمن جوان را برای بازی در نقش دیوید سامنر در فیلم سگ‌های پوشالی برگزید.
اوج دوران حرفهای داستین هافمن به دهه ۷۰ برمی گردد که در این سال ها به همراه دنیرو و پاچینو نسل تازه‌ای بودند که قرار بود آینده را تسخیر کنند.
داستین هافمن پس از دریافت دومین اسکارش، تقریبا به محاق رفت. در سال‌های دهه ۹۰ که شاهد اوجگیری دوباره هم‌نسلان او هستیم او نقش آنچنان چالش برانگیزی نیافت تا خودش را احیا کند.
فیلم «شهر دیوانه» ساخته کوستا گاوراس تا حدودی بار دیگر نام او را بر سر زبان‌ها انداخت؛ اما نقشی بنیادی برای بازیگری که دو بار جایزه اسکار گرفته نبود.
هافمن تا پیش از «راه مهتاب» ۳ سال از سینما دور بود. او دلیل این کار را استراحت و دوری از مناسباتی می‌داند که با آنها بیگانه است.
او نسبت به نحوه تولید فیلم‌ها و بازاریابی‌شان در هالیوود به شدت معترض است و معتقد است که دلیل اصلی مشکلات سینما، وجود همین دلال بازی‌های احمقانه است.
در آوریل سال ۱۹۹۹ هافمن در یک مراسم تلویزیونی مورد ستایش قرار گرفت و جایزه دستاوردهای مادام العمر را دریافت کرد که این عنوان در سال ۲۰۰۳ تکرار شد.
داستین هافمن یکی از مؤثرترین و مهم‌ترین بازیگران تاریخ سینما در ۲ ژانر کمدی و درام به حساب می‌آید و همانند بازیگران ممتاز هم نسل خود مثل آل پاچینو، رابرت دنیرو و مارلون براندو همیشه جاودانه است.
او ۷ بار کاندیدای دریافت اسکار شده و ۲ بار این جایزه را به خاطر بازی در فیلم‌های کریمر علیه کریمر و مرد بارانی تصاحب کرده است.
همچنین از دیگر افتخارات سینمایی داستین هافمن طی چهار دهه بازیگری می‌توان به ۳ جایزه بهترین بازیگر مرد از بافتا انگلستان، خرس طلای افتخاری جشنواره برلین (۱۹۸۹)، سزار افتخاری از اسکار سینمای فرانسه (۲۰۰۹)، چهار جایزه بهترین بازیگر مرد از قدیمی‌ترین جوایز فیلم ایتالیا، دوربین طلای سینمای آلمان برای یک عمر دستاورد شغلی (۲۰۰۳)، ۵ جایزه بهترین بازیگر مرد از گلدن گلوب آمریکا، شیر طلای افتخاری جشنواره ونیز(۱۹۹۶) و نشان ملی هنر و ادبیات فرانسه (۲۰۰۹) اشاره کرد.
برخی از افتخارات داستین هافمن:
- نامزد دریافت اسکار بهترین بازیگر به خاطر بازی در فارغ التحصیل - ۱۹۶۷
- نامزد دریافت اسکار بهترین بازیگر به خاطر بازی در کابوی نیمه شب - ۱۹۶۹
- نامزد دریافت اسکار بهترین بازیگر به خاطر بازی در فیلم لنی - ۱۹۷۴
- نامزد دریافت اسکار بهترین بازیگر به خاطر بازی در توتسی - ۱۹۸۲
- برنده اسکار بهترین بازیگر مرد به خاطر بازی در کرامر علیه کرامر - ۱۹۷۹
- برنده اسکار بهترین بازیگر مرد به خاطر بازی در فیلم مرد بارانی - ۱۹۸۸
برخی از آثار هنری داستین هافمن:
- ببر موفق می‌شود - ۱۹۶۷
- فارغ‌التحصیل - ۱۹۶۷
- کابوی نیمه‌شب - ۱۹۶۹
- جان و ماری - ۱۹۶۹
- بزرگمرد کوچک - ۱۹۷۰
- هری کلرمن کیست و چرا این حرفهای وحشتناک را درباره‌ام می‌زند - ۱۹۷۱
- سگ‌های پوشالی - ۱۹۷۱
- آلفردو، آلفردو - ۱۹۷۲
- پاپیون -۱۹۷۳
- لنی -۱۹۷۴
- همه مردان رئیس جمهور - ۱۹۷۶
- ماراتن من - ۱۹۷۶
- زمان درستکاری - ۱۹۷۸
- کرامر علیه کرامر - ۱۹۷۹
- آگاتا - ۱۹۷۹
- توتسی - ۱۹۸۲
- مرگ دستفروش -
۱۹۸۵
- گفتگوی خصوصی - ۱۹۸۶
- ایشتار - ۱۹۸۷
- مرد بارانی - ۱۹۸۸
- کسب و کار خانوادگی - ۱۹۸۹
- دیک تریسی - ۱۹۹۰
- بیلی بتگیت - ۱۹۹۰
- هوک - ۱۹۹۱
- قهرمان - ۱۹۹۲
- هورتون صدای یک هو را می‌شنود! - ۱۹۹۲
- شیوع - ۱۹۹۵
- بوفالوی آمریکایی - ۱۹۹۶
- خواب‌گردها - ۱۹۹۶
- شهر دیوانه - ۱۹۹۷
- سگ را بجنبان - ۱۹۹۷
- کره - ۱۹۹۸
- پیام‌آور: سرگذشت ژاندارک - ۱۹۹۹
- مسیر مهتابی - ۲۰۰۲
- اعتماد - ۲۰۰۳
- هیئت‌منصفه فراری - ۲۰۰۳
- در جستجوی ناکجاآباد - ۲۰۰۴
- هاکبی‌ها را دوست دارم - ۲۰۰۴
- ملاقات با فاکرها - ۲۰۰۴
- راه‌های مسابقه، صدا - ۲۰۰۵
- شهر گمشده - ۲۰۰۵
- عطر: قصه یک آدمکش - ۲۰۰۶
- عجیب‌تر از داستان - ۲۰۰۶
- تعطیلات - ۲۰۰۶
- فروشگاه عجیب آقای مگوریوم - ۲۰۰۷
- پاندای کونگ‌فوکار - ۲۰۰۸
- داستان دسپروکس - ۲۰۰۸
- آخرین شانس هاروی - ۲۰۰۸
- روایت بارنی - ۲۰۱۰
- فاکرهای کوچک - ۲۰۱۰
- پاندای کونگ‌فو کار، صدا - ۲۰۱۱
- The Giver - ۲۰۱۱